在这项研究中，研究人员试图系统评估插入序列的长度和组成、细胞系、目标位点以及prime editor的不同版本如何影响插入效率。

为此，他们共设计了3,604条pegRNA，编码切口位点上游的插入物，这些插入物的长度从1nt到69nt不等，且GC含量不同。他们将序列插入两个细胞系（HEK293T和HAP1细胞）中，靶向四个目标位点（HEK3、EMX1、FANCF和CLYBL）。一周后，他们对这些细胞进行基因组测序，观察编辑是否成功。评估插入效率的整体策略详见图1。

图1 prime插入效率的高通量测定

由于插入率的变化跨越了三个数量级，于是研究人员试图了解相关的特征，首先是插入物的长度。他们在HEK293T细胞中发现了两个特点：3和4nt序列的插入率高于其他序列；15-21nt序列的插入率高于周围的序列。不过在HAP1细胞中，1-4 nt短序列的插入率并没有高于较长序列。他们将其归因于错配修复（MMR）系统，因为HEK293T细胞在MMR上存在部分缺陷。敲除错配修复基因MLH1的HAP1细胞也证明了这一点，表明MMR系统阻碍了短序列的插入。

之后，他们分析了prime editing的不同步骤如何影响序列的插入率。他们发现，若pegRNA中带有四个或更多的连续腺嘌呤，则插入率会大大下降。此外，prime editing中的另一个重要步骤是带有5 flap（包含野生型序列）和3 flap（包含插入物）的中间产物之间达到平衡，而5 flap核酸酶FEN1及3 flap核酸酶TREX1和TREX2介导了这种平衡。他们发现，3 flap核酸酶TREX1和TREX2抑制了较长序列的插入。

同时，插入序列的核苷酸组成和二级结构也会影响插入率。研究人员发现，prime editing系统对胞嘧啶有着明显的偏好。插入序列中每增加1%的胞嘧啶，则插入率平均增加2.2%。相反，腺嘌呤和胸腺嘧啶的百分比则降低了各个位点的插入率。此外，他们还发现，结构强度更高的序列能够被更有效地插入。

在此过程中，他们使用了Twist Bioscience提供的寡核苷酸池。据Twist介绍，他们独特的硅基DNA合成平台能够在单次运行中生成超过一百万条寡核苷酸，对数量几乎没有限制，而且寡核苷酸池均一，让人们对实验结果充满信心。此外，实验中使用的多个载体和基因片段也是由Twist Bioscience提供的。