核质转运Cas13d的开发：研究中开发的核质转运Cas13d（nucleocytoplasmic shuttling Cas13d, Cas13d-NCS）能有效将CRISPR RNA（crRNA）从核内转移到细胞质，实现了在细胞质内靶向降解RNA。

提升对细胞质RNA病毒的抗病毒效能：该系统针对如委内瑞拉马脑炎（Venezuelan equine encephalitis, VEE）病毒和多种严重急性呼吸综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）的菌株显示出显著的抗病毒活性，能完全阻断这些病毒的复制。

潜在的临床应用前景：Cas13d-NCS展示了其在精确调控亚细胞层面RNA靶向和开发新型分子工具及治疗RNA相关疾病的巨大潜力。

Cas13d-NCS（核-胞质穿梭型Cas13d）为高效靶向细胞质RNA和抗病毒设计的工程过程。

a. Cas13d蛋白及其crRNA在哺乳动物细胞中的表达和定位的示意图。Cas13d-NES在C端具有一个NES，对应于v5变体。

b. 使用RNA FISH染色技术，对表达核定位Cas13d-NLS（含3个NLS，即核定位序列，对应于f中的v1）的细胞中的crRNA及GAPDH mRNA进行染色的结果。

c. Cas13d-NCS的示意图，显示其如何将crRNA从核部运输到细胞质。

d. 与核型（v1）或穿梭型Cas13d（v3）共表达的由RNA聚合酶III表达的crRNAs的RNA FISH染色。

e. 对共表达的核型和穿梭型Cas13d的细胞中细胞质/总crRNA染色强度的定量分析。

f. 不同NLS/NES组合的Cas13d穿梭构建的示意图。

g. 不同变体v1-v5的Cas13d蛋白在细胞质/总蛋白染色强度的定量分析。

h. 比较了Cas13d变体v1-v5在纳米荧光素酶表达抑制方面的效果。

i. VEE病毒报告子复制体的示意图。

j. 短期和长期培养后表达复制体的细胞的荧光成像。

k. 使用流式细胞术比较核型和穿梭型Cas13d-NCS在靶向复制体效率上的结果。

l. 针对单一3 UTR crRNA靶向的SARS-CoV-2-GFP报告病毒和病毒转录组的示意图。

m. 在不同靶向条件下通过整合GFP强度实时测量SARS-CoV-2-GFP病毒载量。

n. 在用Cas13d-NCS和靶向或非靶向3 UTR crRNA处理48小时后，通过RNA测序分析SARS-CoV-2（Delta）亚基因组mRNA表达。（Credit:Cell Discovery）