从小鼠到灵长类动物的跨越，不仅意味着EHM技术正在向临床应用迈进，也大幅提高了实验结果对人类的参考价值。

恒河猴EHM的配制与特性分析（Credit:Nature）

1. 恒河猴EHM的构建过程（a）

该部分描述了从恒河猴诱导多能干细胞（iPSCs）开始，如何分化生成心肌细胞（CMs）和基质细胞（StCs），并最终构建EHM。具体流程如下：

干细胞分化：研究人员首先使用中胚层诱导（mesoderm induction）策略，使恒河猴iPSCs向心肌细胞（CMs）和基质细胞（StCs）分化。第10天和第22天，研究人员使用免疫荧光染色检测心肌细胞中肌节肌动蛋白（sarcomeric actinin, ACTN2，绿色）的表达，确认其心肌表型。第20天，通过表皮-间充质转分化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）诱导，促进基质细胞（StCs）的形成，并通过波形蛋白（vimentin, VIM，绿色）染色进一步确认。

EHM的构建：研究人员将分化后的心肌细胞（CMs）和基质细胞（StCs）嵌入I型牛胶原水凝胶（bovine collagen type I hydrogels），并铸造成特定形态的支架，以培养形成EHM。EHM的两种培养模式：环状EHM（450 L体积）：用于收缩功能测试，评估其生理特性。贴片状EHM（8 mL体积）：用于恒河猴心脏移植实验，评估其在活体内的表现。

此外，该研究还采用相同的实验流程构建了人类EHM，以便在后续试验中进行比较分析。

2. EHM的细胞组成分析（b）

该部分使用流式细胞术（flow cytometry）对EHM的细胞成分进行了定量分析，比较了人类EHM（n=18）和恒河猴EHM（n=4）的细胞组成：心肌细胞（CMs）：ACTN2+；基质细胞（StCs）：VIM+/ACTN2 。结果发现：人类EHM和恒河猴EHM在细胞比例上具有一定相似性，但仍存在一定程度的变异。

3. EHM的组织结构分析（c）

研究人员进一步对EHM进行了整体免疫荧光染色（whole-mount staining），分别检测了人类EHM（n=1）和恒河猴EHM（n=3）中的心肌结构，染色指标包括：ACTN2（绿色）：标记心肌细胞的肌节结构。DAPI（蓝色）：标记细胞核。结果显示：无论是人类EHM还是恒河猴EHM，心肌细胞均形成了肌节排列的结构，表明其已初步具备心肌组织的生理特性。

4. EHM的功能性评估（d）

研究人员通过等长条件（isometric conditions）下的电场刺激（electrical field stimulation, 1.5 Hz），测定了EHM的收缩能力。实验结果表明：在电刺激下，EHM表现出明显的节律性收缩，表明其具备基本的心肌功能。

关键突破：EHM移植物如何长期存活？

让EHM真正 活 在心脏里，是该研究的核心挑战之一。心肌组织是高度依赖血液供应的活性组织，一旦缺乏足够的氧气和营养，移植物很容易。此外，宿主的免疫系统也可能攻击移植细胞，导致移植物无法长期存活。

为了克服这些问题，研究人员采取了多层次优化策略，确保EHM在恒河猴心脏中能够长期存活并保持功能：